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        ELISA實驗代測步驟

        更新日期: 2025-03-07
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          ELISA是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù),可以用于檢測血液、尿液、唾液、霉菌、病毒、細(xì)菌等生物樣品中的蛋白質(zhì)、抗體、肽等生物分子。
         
          ELISA全名是酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)的縮寫,是一種利用酶標(biāo)記化的抗體或反體與待檢測物(抗原或抗體)結(jié)合,從而間接或直接檢測目標(biāo)分子的技術(shù),屬于免疫學(xué)中的非放射性標(biāo)記方法之一。
         
          ELISA實驗代測步驟:
         
          一般分為六個步驟:涂覆微孔板、酶標(biāo)記化的抗體反應(yīng)、樣品添加、次級抗體結(jié)合、添加底物、測量光密度。
         
          1.涂覆微孔板
         
          將捕獲抗體、配體或抗原涂覆在微孔板上,使之附著在微孔板的底部或壁上,固定在樣品檢測位置或加標(biāo)準(zhǔn)的位置。同時,涂覆后還需要加入一些特殊蛋白或物質(zhì),例如牛血清白蛋白(BSA)等,將微孔板的其他部分進(jìn)行屏蔽,以防止非特異性結(jié)合。
         
          2.酶標(biāo)記化的抗體反應(yīng)
         
          將酶標(biāo)記化的初級抗體與樣品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng),待時間到達(dá)絕大部分初級抗體與待檢測物或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特異性結(jié)合時,將液不沖洗干凈。
         
          3.樣品添加
         
          將待檢樣品加入涂覆好初級抗體的微孔板中,讓待檢樣品以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特異性結(jié)合到微孔板上涂覆好的初級抗體中。該過程也需要將板子洗液清洗干凈。
         
          4.次級抗體結(jié)合
         
          將酶標(biāo)記化的次級抗體加入孔內(nèi),經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間,使之與待測樣中的物質(zhì)結(jié)合。該步驟結(jié)束后,需要將板子進(jìn)行洗滌,以消除非特異性結(jié)合。
         
          5.添加底物
         
          將含有酶基團(tuán)的底物加入微孔板中,例如TMB、ABTS等底物,如果樣品物質(zhì)合適,底物在酶催化下會產(chǎn)生顯色反應(yīng)。直觀表示是微孔板中某些孔的液體呈現(xiàn)橘黃色,根據(jù)底物種類的不同,孔底深度和底物的反應(yīng)時間也會有所不同。
         
          6.測量光密度
         
          在吸光度計或ELISA檢測儀器上對微孔板進(jìn)行讀數(shù),根據(jù)微孔板中總體積、底物的反應(yīng)時間和吸收量來計算樣品中待檢測物質(zhì)的濃度。通常,結(jié)果是一個數(shù)字,可以根據(jù)該數(shù)字來評估待檢測物質(zhì)的存在程度或含量。
         
          實驗注意事項:
         
          1.微孔板的處理
         
          微孔板是ELISA實驗中的重要物品,拆開之前必須放在干凈的環(huán)境中進(jìn)行消毒,盡量避免接觸銳器或其他銳利物品,使用完后及時封閉保存,避免受到污染。
         
          2.操作流程的嚴(yán)謹(jǐn)性
         
          實驗需要嚴(yán)格的操作流程和重復(fù)性,每個流程必須按照操作規(guī)程進(jìn)行,且操作者必須熟練掌握操作技巧和注意事項,避免因操作不當(dāng)引起實驗的誤差。
         
          3.化學(xué)品的正確使用
         
          實驗中需要使用各種化學(xué)試劑,包括酶標(biāo)記的抗體、底物、緩沖液、洗滌液等,每個化學(xué)品都有其特殊的儲存、使用和處理方法,必須按照說明書的要求進(jìn)行正確使用,避免發(fā)生安全事故或影響實驗結(jié)果。
         
          4.數(shù)據(jù)的分析
         
          ELISA測量數(shù)據(jù)的分析非常重要,必須進(jìn)行合理的分析和解釋,避免由于數(shù)據(jù)誤差或結(jié)果解釋不當(dāng)而導(dǎo)致實驗結(jié)論的錯誤。
         

         


         
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